调控miRNA的活性小分子的发现和作用机制研究

【摘要】MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控基因表达功能的非编码小RNAs,可以在转录后水平调控基因的表达,通过与靶mRNA3’非编码区(3’UTR)特异性地结合,导致靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻译。由于miRNAs在基因水平广泛的调控作用使得它们成为引人注目的生物标志物和各种疾病治疗的潜在靶点。对细胞内miRNAs的表达或功能具有调控活性的化学小分子可以作为分子探针用于研究细胞内miRNA的调控网络,而且基于其对重要疾病相关的miRNA的调控可能在将来的疾病治疗方面有着潜在的重要作用,论文主要围绕筛选对多种miRNA具有调控活性的化学小分子及其相关的调控机制展开了化学生物学的研究工作,主要研究内容分以下四个部分：1.基于活细胞的miRNA小分子调控剂筛选体系的构建。在本部分研究中,我们分别应用了两种报告基因系统,即荧光素酶报告基因和绿色荧光蛋白报告基因,使得细胞内特定miRNA受化合物调控的情况可通过细胞产生的生物发光信号或荧光信号的变化读出。在基于荧光素酶报告基因的筛选体系中,将需检测的miRNA的互补序列插入荧光素酶基因的3’UTR端,构建好的质粒转染进入细胞中。正常情况下,细胞内源性的miRNA可以和它的靶序列结合,导致Luciferase的表达受到抑制,在化学小分子刺激细胞后,细胞内源性的miRNA表达或功能可能受到调节,而小分子对细胞内特定miRNA是否具有调控作用以及调控活性的相对强弱通过报告基因表达产生的生物发光信号的相对变化给出初步的判断。用绿色荧光蛋白作为报告基因的筛选系统构建基于同样的原理,但需通过细胞流式仪来检测细胞在经化学小分子刺激后荧光的变化,因而其在筛选活性小分子时不能实现高通量,有一定的局限性。2.对小分子化合物库中小分子的毒性及调控miRNA活性的评估。基于论文第一部分工作中构建的荧光素酶报告基因的活性分子筛选体系,我们首先对本实验室经过光反应等合成方法得到的小分子库中的化学小分子进行了细胞毒性及调控细胞内miRNA活性的初步评估。针对在10μM浓度下没有明显细胞毒性的小分子,我们分别测试了它们在Hela细胞中对与癌症发生密切相关的miR-21、在C2C12细胞中对肌肉特异性miR-1及miR-133、在HepG2细胞中对肝脏特异性miR-122等miRNA的调控活性,为我们寻找不同类型的miRNA小分子调控剂所具有的结构特征提供了基础的信息。3.对miRNA具有广谱激活作用的活性小分子的获取及其调控机制研究。从1,4-萘醌和二苯乙炔的光反应产物中我们初筛得到了一个活性小分子2a-4,其对miR-21、miR-1及miR-122等多种类型的miRNA都显示出了激活作用,是miRNA的广谱激活剂。对于miRNA广谱激活细胞内miRNA的机制我们也进行了探索,结果显示该小分子作用后的细胞中各种前体miRNA(pre-miRNA)的水平降低,而成熟体miRNA的表达水平被显著提升,显示化合物在细胞中可促进pre-miRNA至成熟体miRNA的加工成熟过程。进一步对细胞内与miRNA加工成熟密切相关的功能蛋白包括AGO2,TRBP等的表达水平在化合物作用前后的比较显示化合物可能通过上调TRBP的表达实现对miRNA的广谱激活。4.广谱激活剂型小分子探针构建方法的探索。基于论文第三部分所发现的广谱抑制剂小分子2a-4,我们通过1,4-萘醌与其它芳基取代炔烃的光化环加成反应合成了一系列2a-4的类似物,希望从中获取相关的结构-活性关系的重要信息以构建带有生物正交官能团的小分子探针。并对这类化合物的活性进行了深入研究。遗憾的是,经过大部分取代基团修饰的2a-4的类似物在10μM浓度下都表现出较强的细胞毒性,而将化合物在无明显毒性的浓度下处理细胞后,其对细胞内miRNA的激活活性也随之大幅下降,因此在这些结构部位修饰生物正交官能团的可行性不大。
【作者】陈雪姣；
【导师】张艳；
【作者基本信息】南京大学，有机化学，2013，博士
【关键词】活性分子；毕业论文；报告质粒；Luciferase；报告基因；作用机制；荧光素酶基因；基因表达；细胞分化；环加成反应；

【参考文献】
[1]杜新芝.益气健脾法联合艾塞那肽对2型糖尿病患者血糖控制及胰岛功能的影响[D].成都中医药大学,中医内科学,2012,硕士.
[2]谢洪明,王倩,程聪,陈盈.网络非重复性、企业学习能力与技术创新关系研究[J].研究与发展管理,2013,04:41-48.
[3]邹忠.秦汉农民犯罪研究[D].首都师范大学,中国古代史,2004,硕士.
[4]薛少阳.基于概念隐喻理论的苏轼词分析[D].华东交通大学,中国古代文学,2011,硕士.
[5]曾方.河南赊店控股有限公司品牌营销战略研究[D].西安建筑科技大学,工商管理,2013,硕士.
[6]张宇.水晶石数字科技有限公司的市场营销分析[D].西南财经大学,2003.
[7]蔡伯根.低成本列控系统的列车组合定位理论与方法[D].北京交通大学,2010.
[8]陈旭辉.数据压缩在数字微波射频拉远系统中的应用研究[D].武汉邮电科学研究院,通信与信息系统,2012,硕士.
[9]敖旭涛.中国—新西兰双边自由贸易协定研究[D].西南政法大学,国际法学,2012,硕士.
[10]刘婵媛.我国企业商号法律保护研究[D].兰州商学院,经济法学,2013,硕士.
[11]黄灿.宽带多媒体卫星通信系统地面适配网关的设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2010,硕士.
[12]李星魁.由住宅建筑及商业建筑看我国现行建筑设计规范中存在的若干问题及相应对策[D].天津大学,建筑设计及其理论,2004,硕士.
[13]李楠.基于AHP-FCE模型的保险公司绩效评价研究[D].河北工程大学,企业管理,2012,硕士.
[14]周春祥.名老中医经验总结与传承过程中的问题与思考[J].江苏中医药,2004,12:1-4.
[15]王峻松.企业家培育的外部制度研究[D].湖南大学,企业管理,2003,硕士.
[16]胡玮.聚酯/蚕丝蛋白高功能复合面料研究[D].西南大学,资源纤维学,2013,硕士.
[17]孙诚.我国企业并购会计相关问题研究[D].山西财经大学,会计学,2013,硕士.
[18]赵杰.基于ARM和GPRS的智能温室监控系统的设计[D].河北科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[19]周小娥.关于指数丢番图方程p~x±q~y=2~z[D].海南大学,应用数学,2014,硕士.
[20]张恒旭,刘玉田.考虑频率偏移传播速度各向异性的扰动信息辨识[J].电力系统自动化,2010,22:62-66.
[21]李丹丹,褚有群,李雯雯,马淳安.全钒液流电池用PTFE-碳纳米管电极的性能[J].储能科学与技术,2013,03:227-232.
[22]刘永久.企业信息战略规划及其信息审计研究[D].首都经济贸易大学,信息经济,2004,硕士.
[23]谢亚莉.功能化氧化石墨烯的制备及其应用于多肽和蛋白质的检测研究[D].首都师范大学,分析化学,2014,硕士.
[24]毛元.基于不变特性的指纹识别算法研究[D].华侨大学,信息与通信工程,2013,硕士.
[25]郝晶.液压冲孔—翻边复合工艺研究[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2013,硕士.
[26]贾国栋.多相关周期性时间序列上的异常模式关联规则挖掘[D].东北大学,计算机应用技术,2010,硕士.
[27]司超.美国内战时期工业动员研究[D].山东师范大学,世界史,2013,硕士.
[28]温宏宇.公交车专用道违规车辆识别系统研究[D].大连海事大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[29]陈清源.毛泽东思想方法论及其现实意义研究[D].湖南师范大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[30]郑博文.锥形电极微细电火花铣削补偿方法[D].上海交通大学,机械工程,2014,硕士.
[31]杨海滨.公司资本维持原则诉讼[D].吉林大学,法律,2012,硕士.
[32]于海飞.辩证逻辑思维与中学物理教学[D].东北师范大学,2002.
[33]魏征.基于图统计特征的图像识别算法研究[D].安徽大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[34]黄小春.无源超高频RFID多通信速率基带设计与实现[D].西安电子科技大学,微电子学与固体电子学,2010,硕士.
[35]马宏云.挖掘机工作装置的模糊控制及实验研究[D].哈尔滨工业大学,机械工程,2014,硕士.
[36]赵宪龙.基于ARM与μC/OS-Ⅱ的数据采集平台应用研究[D].中国石油大学（华东）,控制工程,2012,硕士.
[37]王索因.曲江旅游景区游客现场管理与创意提升策略研究[D].西安外国语大学,旅游管理（专业学位）,2013,硕士.
[38]樊秀月.甲状腺乳头状癌颈部中央组淋巴结转移的相关因素及清扫方式的探讨[D].广西医科大学,胃肠腺体外科（专业学位）,2013,硕士.
[39]王翠钦.模型和代码的一致性检测方法的研究[D].重庆大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[40]黄勇1,2,解立峰1,鲁长波3,安高军3,熊春华3,朱英中4.柴油云雾最小点火能量的实验研究[J].高压物理学报,2015,02:.
[41]张晓锋.基于随机几何图的无线传感器网络拓扑控制[D].西安电子科技大学,应用数学,2013,硕士.
[42]刘勇,徐从富.基于远程动态编译方式的网上合作研究平台[J].计算机应用与软件,2004,08:21-22+118.
[43]汪胜兰.民勤绿洲农村社区人口迁移理论与实证研究[D].兰州大学,人文地理学,2013,硕士.
[44]熊小萍.基于移动代理的入侵检测系统研究[D].广西大学,2005.
[45]黎燮君.广州市番禺区政府防汛建设管理机制研究[D].东北师范大学,公共管理（专业学位）,2012,硕士.
[46]贾凌云,李冬妮,田云娜.基于混合蛙跳和遗传规划的跨单元调度方法[J].自动化学报.
[47]霍虎伟.航海模拟器中全回转拖轮操纵运动建模与仿真[D].大连海事大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[48]廖明怡.CRM及其在电信业的应用[J].东北财经大学学报,2005,02:51-52.
[49]谭锦绣.提高自我同情水平对缓解高三学生考试焦虑的干预研究[D].西南大学,发展与教育心理学,2014,硕士.
[50]曹海江.环境犯罪严格责任的制度完善[D].宁波大学,刑法学（专业学位）,2012,硕士.